熒光定量PCR(細胞膜熒光探針DIR)所使用的熒光化學制劑可分為兩種：熒光探針和熒光染料。PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5’－3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。

　　實時熒光PCR(細胞膜熒光探針DIR)技術靶基因的確定及引物和探針的設計原則

　　1．靶基因的確定：選擇檢測組共有的基因以避**測的假陰性(漏檢)。

　　2．檢測片段的確定：選擇檢測組內(nèi)的保守 (突變少)（避免假陰性）、組間特異的序列 (突變多)（避免假陽性）作為引物探針的設計位置。片段長度70-150bp。

　　3．引物：長度17-25bp;GC含量30-80%；退火溫度(Tm值)58-60℃；避免穩(wěn)定的引物二聚體（特別是多聯(lián)檢測）及發(fā)夾結(jié)構(自由能大于-3.5kc/m)；序列不能出現(xiàn)連續(xù)的G，3’端避免G或C，*后5個堿基內(nèi)避免兩個以上的G或C。

　　4．探針：長度20-30bp（Taqman)或16-25bp(MGB)；GC含量30-80%；Tm值為68-70℃；避免穩(wěn)定的二聚體及發(fā)夾結(jié)構 (自由能大于-3.5kc/m)；5’端不能是G；位置盡量靠近上游引物；選擇波長差異較大（多聯(lián)檢測）或Fam(單聯(lián)檢測）的熒光標記。

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