膜聯(lián)蛋白V結合物在Ca2+存在下與凋亡細胞表面上的PS結合，它也可以通過壞死細胞膜或死細胞并與細胞內(nèi)部的PS結合。 因此，我們建議將細胞不可滲透的核染色與膜聯(lián)蛋白V結合物結合使用，以區(qū)分死細胞和凋亡細胞。百螢生物是AAT Bioquest的中國代理商，為您提供的Annexin V-mFluor Violet 450標記探針。 

光譜：

光譜性質

吸光度(nm)：        406

校正因子(260海里)： 0.338

校正因子(280海里)： 0.078

消光系數(shù)(cm 1米1)：350001

激發(fā)：                    406 (nm)

發(fā)射(nm)：              445

量子產(chǎn)率：               0.811

實驗方案

分析方案

概述

用測試化合物（200μL/樣品）制備細胞

添加Annexin V結合物測定溶液

室溫孵育30-60分鐘

用流式細胞儀或熒光顯微鏡分析

1.用膜聯(lián)蛋白V綴合物制備和孵育細胞：

1.1制備膜聯(lián)蛋白V結合測定緩沖液：10mM HEPES，140mM NaCl和2.5mM CaCl2，pH 7.4。

1.2用測試化合物處理細胞一段所需的時間（用星形孢菌素處理的Jurkat細胞4-6小時）以誘導細胞凋亡。

1.3離心細胞，得到1-5×105個細胞/管。

1.4將細胞重懸于200μL膜聯(lián)蛋白V結合測定緩沖液中（來自步驟1.1）。

1.5在細胞中加入2μL膜聯(lián)蛋白V結合物。

可選：在細胞內(nèi)加入死細胞染色劑如碘化丙錠，用于壞死細胞。

1.6在室溫下孵育30至60分鐘，避光。

1.7在用流式細胞儀或熒光顯微鏡分析細胞之前，加入300μL膜聯(lián)蛋白V結合測定緩沖液（來自步驟1.1）以增加體積（參見下面的步驟1.8）。

1.8使用流式細胞儀或熒光顯微鏡監(jiān)測熒光強度（參見下面的步驟2或3）。

2.使用流式細胞儀分析：

通過使用具有適當過濾器的流式細胞儀來量化膜聯(lián)蛋白V綴合物。

注意：粘附細胞上的膜聯(lián)蛋白V結合流式細胞術分析未經(jīng)常檢測，因為在細胞分離或收獲期間可能發(fā)生特定的膜損傷。 然而，Casiola-Rosen等人先前報道了利用膜聯(lián)蛋白V對貼壁細胞類型進行流式細胞術的方法。 和van Engelend等人（見參考文獻1和2）。

3.使用熒光顯微鏡分析：

3.1移取步驟1.6的細胞懸液，用膜聯(lián)蛋白V結合測定緩沖液（來自步驟1.1）沖洗1-2次，然后用膜聯(lián)蛋白V結合測定緩沖液（來自步驟1.1）重懸細胞。 將細胞添加到蓋有玻璃蓋玻片的載玻片上。

注意：對于粘附細胞，建議直接在蓋玻片上生長細胞。 與膜聯(lián)蛋白V綴合物孵育（步驟1.6）后，用膜聯(lián)蛋白V結合測定緩沖液（來自步驟1.1）沖洗1-2次，并將膜聯(lián)蛋白V結合測定緩沖液（來自步驟1.1）加回到蓋玻片中。 在玻璃載玻片上翻轉蓋玻片并觀察細胞。 在與膜聯(lián)蛋白V綴合物孵育后，細胞也可以在2％甲醛中固定，并在顯微鏡下觀察。

3.2在熒光顯微鏡下用適當?shù)臑V光片分析膜聯(lián)蛋白V綴合物的凋亡細胞

圖1所示。膜聯(lián)蛋白的檢測綁定活動V-mFluor?紫450共軛Jurkat細胞磷脂酰絲氨酸。Jurkat細胞**沒有(綠色)或1μM staurosporine(紅色)為4小時37oC,然后貼上膜聯(lián)蛋白V-mFluor?紫450共軛30分鐘。熒光強度測量使用究NovoCyte流式細胞分析儀在太平洋藍色通道。