胱天蛋白酶的熒光FMK肽抑制劑被廣泛用于檢測活細胞中的胱天蛋白酶活性，但該技術(shù)有一些嚴重的局限性：a）FMK半胱天冬酶抑制劑具有很高的細胞毒性，因為FMK肽與活性胱天蛋白酶共價結(jié)合。 b）FMK肽與caspase的不可逆共價結(jié)合會抑制caspase活性，導(dǎo)致假陽性凋亡。 C） FMK分析具有極高的背景，并且需要大量洗滌，從而導(dǎo)低的通量。 d）FMK肽在水溶液中不穩(wěn)定，必須立即使用。 ApoSight Green Caspase 3/7底物可以用96孔或384孔板進行實驗，并易于適應(yīng)自動化。下面我們一起來了解該產(chǎn)品的實驗方案及實驗過程吧。

適用儀器

流式細胞儀

Ex:                  488 nm 激發(fā)

Em:                 530/30 nm 濾波片

通道：               FITC通道

熒光顯微鏡

Ex:                  FITC濾波片組

Em:                 FITC濾波片組

推薦板孔：          黑色透明底板

實驗方案

樣品實驗方案

簡要概述

1.使用96孔板的密度為5×104至2×105細胞/ 100 μL /孔的待測化合物制備細胞
2.加入等體積的ApoSight Caspase 3/7底物工作溶液
3.在5％CO2培養(yǎng)箱中于37°C孵育60分鐘
4.用HHBS洗滌細胞1-2次
5.使用帶有530/30 nm濾波片（FITC通道）的流式細胞儀或帶有FITC濾波片組的熒光顯微鏡分析細胞

溶液配制

1.儲備溶液配制

所有未使用的儲備溶液應(yīng)分為一次性使用的等分試樣，并在制備后儲存在-20°C下。 避免重復(fù)凍融循環(huán)。

ApoSight Green Caspase 3/7底物儲備液（200X）
在ApoSight 綠色胱天蛋白酶3/7底物瓶中加入50 μL DMSO，制成200X ApoSight 綠色胱天蛋白酶3/7底物原液。
注意，一次性使用等分試樣，以避免重復(fù)的凍融循環(huán)。

2.工作溶液配置

ApoSight Green Caspase 3/7底物工作溶液

在ApoSight 綠色胱天蛋白酶3/7底物瓶中加入50 μL DMSO，制成200X ApoSight 綠色胱天蛋白酶3/7底物原液。
注意，一次性使用等分試樣，以避免重復(fù)的凍融循環(huán)。

樣品示例及操作

懸浮培養(yǎng)中誘導(dǎo)細胞凋亡的實例

1.用2μg/ mL喜樹堿處理Jurkat細胞3小時
2.用1μM星形孢菌素處理Jurkat細胞3-4小時
3.用4μg/ mL喜樹堿處理HL-60細胞4小時
4.用1μM星形孢菌素處理HL-60細胞4小時。
注意，應(yīng)對每個細胞系進行單獨評估，以確定誘導(dǎo)凋亡的佳細胞密度。

熒光顯微鏡的樣品方案

1.用5×104至2×105個細胞/ 100 μL /孔/ 96孔板的密度制備含待測化合物的細胞。
2.向細胞中加入等體積的Caspase 3/7底物工作溶液（100 μL /孔/ 96孔板）。
3.在5％CO2培養(yǎng)箱中于37°C孵育60分鐘。
4.用HHBS或您選擇的緩沖液洗滌細胞1-2次。
5.使用FITC濾波片組的熒光顯微鏡成像。

流式細胞術(shù)的樣品方案

1.以1：200的比例將200 X ApoSight Green Caspase 3/7底物原液添加到細胞溶液中，并在5％CO2培養(yǎng)箱中于37°C孵育細胞60分鐘。
注意，用于ApoSight Green Caspase 3/7底物標(biāo)記的細胞可濃縮至約5 X 106細胞/ mL。適當(dāng)?shù)姆跤龝r間取決于所用的單個細胞類型和細胞濃度。
2.使用530/30 nm濾波片（FITC通道），通過流式細胞儀檢測熒光強度。
注意，要增加信號/背景比，請以約200 g的速度旋轉(zhuǎn)細胞5分鐘，用1 mL洗滌緩沖液（例如HHBS或所選緩沖液）洗滌細胞，然后將細胞重懸至所需的洗滌量。

圖示

圖1.使用ApoSight 綠色胱天蛋白酶3/7底物檢測Jurkat細胞中胱天蛋白酶3/7活性。將Jurkat細胞（200,000個細胞/孔/ 96孔板）用1μM星形孢菌素或DMSO處理4小時。將細胞與Caspase 3/7底物工作溶液在37°C下孵育1小時。使用FITC濾波片組，用熒光顯微鏡拍攝圖像。