AAT Bioquest:低豐度靶標染色神器----TSA和PSA

今天，要給大家介紹一種用于細胞和組織中低豐度靶標的高分辨率成像技術。TSA/PSA是一種成熟的細胞信號放大技術，當TSA/PSA與我們光穩(wěn)定性、水溶性的iFluor染料結合后，產生的熒光信號具有比傳統(tǒng)組織化學、細胞化學和熒光方法產生的信號更高的檢測靈敏度。PSA是美國AAT Bioquest自主研發(fā)的與TSA功能類似的信號放大方法，其熒光信號強度比廣泛使用的tyramide（TSA）試劑高10-50倍。

TSA/PSA原理

酪胺信號放大（TSA）是一種基于辣根過氧化酶（HRP）的催化活性對靶蛋白或核酸進行高密度原位標記的酶學檢測方法。原理為酪胺Tyramide的過氧化物酶反應（已標記熒光的酪胺在HRP催化H?O?下形成共價鍵結合位點）產生的大量酶促產物與目標蛋白的酪氨酸殘基共價結合，從而使目標蛋白標記上特異的熒光或生物素。

圖1.TSA/PSA原理及工作流程圖。相比較于傳統(tǒng)ICC和IHC方法的工作流程，TSA/PSA試劑可以通過較簡單的步驟實現(xiàn)對所需目標的靈敏檢測。

表1.TSA/PSA技術與傳統(tǒng)熒光對比

TSA/PSA特點

TSA特點

1.適用廣，多色標記

2.多重標記可避免抗體種屬交叉問題

3.染色特異性好，信號強度高，適合低豐度靶標

4.石蠟切片樣本熒光染色背景干凈

PSA特點

1.檢測靈敏度提高了100多倍，比標準IHC，ICC，IF方法高出100倍

2.改進的熒光信號比酪胺（TSA）試劑高10至50倍

3.PSA 自由基的更高反應性允許在HRP-靶相互作用位點更快速，有效和更穩(wěn)定記Styramide綴合物。

4.在不降低靈敏度的情況下，PSA可以使用更少量的抗體/探針

TSA/PSA部分實驗結果展示

圖2.分別用iFluor 488 PSA和Alexa Fluor 488 TSA染色甲醛固定的石蠟包埋人肺腺癌陽性組織的染色結果圖。人肺腺癌陽性組織切片用兔抗EpCam抗體染色，然后用polyHRP標記的山羊抗兔IgG二抗孵育，后使用iFluor 488 PSA （Cat#45020）和Alexa Fluor 488 TSA分別染色。圖像顯示iFluor 488 PSA與Alexa Fluor 488 TSA相比提高了熒光IHC的靈敏度。

圖3.分別用iFluor 488 酪胺和Alexa Fluor 488 酪胺染色甲醛固定的石蠟包埋人肺腺癌陽性組織的染色結果圖。人肺腺癌陽性組織切片用兔抗EpCam抗體染色，然后用HRP標記的山羊抗兔IgG二抗孵育。顯影：iFluor 488 酪胺（左）；Alexa Fluor 488 酪胺（右）。核染色：DAPI

圖4.Styramide 超級信號放大試劑盒的信號強度對比。 （A）將HeLa細胞固定，透化并用各種濃度的兔抗微管蛋白一抗標記，建議的稀釋濃度為：1：500。 然后將細胞直接與AlexaFluor488綴合的山羊抗兔IgG二抗染色，后分別與HRP標記的山羊抗兔IgG二抗、AlexaFluor 488酪胺和iFluor 488 Styramide（#45205）染色。 使用FITC濾光片組拍攝熒光圖像，并以相同的曝光時間進行分析。 （B）測量相對熒光信號強度，并比較不同檢測方法之間的強度。

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